English version
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ДИАГНОСТИКИ ДИРОФИЛЯРИОЗА
У СОБАК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СОМАТИЧЕСКОГО
АНТИГЕНА DIROFILARIA REPENS
Бескровная Ю.Г., Нагорный С.А., Васерин Ю.И.
ФГУН РостовНИИМП Роспотребнадзора
Введение. На юге России отмечена стойкая тенденция возрастания количества инвазированных животных и людей, что обусловлено, прежде всего, высокой пораженностью данным возбудителем собак и отсутствием надлежащих мер по их выявлению и дегельминтизации. В настоящее время установить достоверный диагноз и произвести видовую идентификацию дирофилярий в организме различных хозяев достаточно сложно. У собак (окончательных хозяев) диагностика дирофиляриоза, затруднена из-за того, что данное заболевание может продолжительное время протекать бессимптомно, особенно при низкой микрофиляриемии и отсутствии, или незначительном количестве половозрелых паразитов (Tarello W., 1999). Скрытые инвазии могут быть связаны с препатентной стадией паразита, с "однополыми" гельминтами, с применением противомикрофилярицидной терапии и другими причинами.
Целью настоящего исследования является оценка эффективности соматического очищенного антигена Dirofilaria repens для его использования в диагностике дирофиляриоза у животных с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).
Материалы и методы. В работе использовали специфический антиген полученный из неполовозрелой самки D. repens, удаленной хирургическим путем. Проводили последовательно механическую и ультразвуковую гомогенизацию гельминта из замороженного состояния с экстракцией белков в 0,25 М водном растворе сахарозы. Супернатант растворяли в охлажденном ацетоне, центрифугировали и удаляли надосадочную жидкость. Осадок высушивали под вакуумом, растворяли в калий-фосфатном буфере рН 6,4 и центрифугировали. Надосадочную жидкость использовали в ИФА для выявления антител к Dirofilaria repens у людей, инвазированных данным паразитом. На способ приготовления данного антигена получено положительное решение на патент РФ от 25.11.2008 г.
Полученный антиген использовали в концентрации 40 мкг/мл в объеме 100 мкл на лунку. Разведение сывороток 1:200. В ИФА использованы антивидовые конъюгаты против иммуноглобулинов класса G собаки.
Результаты ИФА учитывали на колориметрическом анализаторе «Opsys MR» фирмы Dynex при длине волны 450нм.
С помощью ИФА были обработаны сыворотки крови 170 домашних собак. Из них у 114 животных в крови были обнаружены микрофилярии, у 56 микрофилярии в крови отсутствовали. В группе собак с микрофиляриемией находились 23 особи с микрофиляриями, идентифицированными по морфологическим признакам как D. repens, 23 – D. immitis и 68 животных, в крови которых обнаружено наличие личинок двух видов паразита. В группу собак свободных от микрофилярий вошли 22 животных, различного пола породы и возраста без признаков болезни, 27 здоровых животных (щенки в возрасте до 5 месяцев) и 7 больных токсокарозом.
Параллельно сыворотки собак были обработаны в коммерческой диагностической тест-системе ELISA (Canine Heartworm Antigen Test Kit) (IDEXX laboratories, США), которая выявляет циркулирующие растворимые антигены Dirofilaria immitis.
Результаты. Результаты иммунологического исследования показали, что в группе больных дирофиляриозом собак с микрофиляриемией выявлено 79,8±3,8% серопозитивных, в группе животных без микрофиляриемии 28,6±6,1%. У щенков и больных другими паразитозами животных положительных результатов не выявлено (табл. 1). Средняя геометрическая титра антител составила: для животных, больных дирофиляриозом (с микрофиляриемией) - 9,5 log2 из них у собак с микрофиляриями D. repens, D. immitis и животных, с личинками обоих видов паразита соответственно: 10,2; 8,3; 10,0 log2. У животных, без признаков болезни (без микрофиляриемии) – 9,6 log2; у щенков – 8,0 log2 и у животных больных другими паразитозами – 8,2 log2 (Р<0,05).
Таблица.Диагностическая эффективность ИФА с соматическим очищенным антигеном Dirofilaria repens
|
№ п.п. |
Группы обследованных |
Кол-во обследованных |
Результаты ИФА |
||
|
положительный (%) |
отрицательный (%) |
СГТА (log2) |
|||
|
1. |
Собаки больные дирофиляриозом (с микрофиляриемией): - D.repens - D.immitis - D.repens и D.immitis |
114 23 23 68 |
79,8±3,8 100,0 - 100,0 |
20,2±3,8 - 100 - |
9,5 10,2 8,3 10,0 |
|
2. |
Собаки свободные от микрофилярий: - животные без клинических признаков дирофиляриоза. - щенки в возрасте до 5 мес. - больные токсокарозом. |
56
22 27 7 |
28,6±6,1
72,7±9,7 - - |
71,4±6,1
27,3±9,7 100,0 100,0 |
8,8
9,6 8,0 8,2 |
Высокие титры антител к D. repens среди животных без микрофиляриемии (9,6 log2), позволяют предположить, что они могли перенести заболевание, по-видимому, в стертой форме. В тоже время, соотношение результатов диагностического теста и отсутствие клинических признаков заболевания в данной группе животных свидетельствуют о наличии ложноположительных результатов. Таким образом, наличие собак без признаков болезни, в крови которых присутствуют антитела к D. repens, позволяют определить специфичность данной тест системы, которая составила 71,4±6,1%.
Для определения антигенемии и паразитемии, исключающие наличие у животных скрытой инвазии D. immitis, и, возможно, перекрестные реакции между двумя видами паразитов, соответствующие сыворотки были обработаны в коммерческой диагностической тест-системе ELISA (Canine Heartworm Antigen Test Kit), которая выявляет антиген D. immitis. В группе больных дирофиляриозом собак (с микрофиляриемией) выявлено 64,0±4,3% серопозитивных, в группе животных без признаков болезни - 77,3±9,1%. Сыворотки крови собак контрольной группы положительных результатов не дали.
У 19,3±3,6% сывороток крови собак в ELISA обнаружены только антигены D. immitis, а в 18,7±3,5% – в ИФА только антитела к антигену D. repens. Это исключает присутствие у последних скрытой инвазии дирофиляриями D. immitis и доказывает высокую специфичность ИФА с антигеном D. repens, а также отсутствие внутривидовых перекрестных реакций. Результаты проведенных исследований показали, что чувствительность ИФА с соматическим очищенным от липидов антигеном D. repens с сыворотками крови больных собак составила 100%.
Заключение. Высокие показатели чувствительности и специфичности ИФА с соматическим очищенным антигеном D. repens позволяют нам считать его эффективным методом диагностики дирофиляриоза у животных, особенно при низком уровне микрофиляриемии или стертой форме инвазии. Это открывает новые перспективы своевременно проводить лечение дирофиляриоза у животных, а также осуществлять дифференциальную диагностику и предотвратить дальнейший риск распространения инвазии на эндемичных по дирофиляриозу территориях.
Литература: 1.Tarello W. La dirofilariose sous-cautanee a Dirofilaria (Nochtiella) repens chez le chien. Revue bibliographique et cas clinique. Revue de Medicine Veterinaire. 150. -1999- Р. 691-702. 2.Simon F., Claudio G. Heartworm infection in humans and animals. Ediciones Universidad de Salamanca. – 2001. – 210 p.
© 2015 The Author(s). Published by All-Russian Scientific Research Institute of Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants named after K.I. Skryabin.
This is an open access article under the Agreement of 02.07.2014 (Russian Science Citation Index (RSCI) and the Agreement of 12.06.2014 (CABI.org / Human Sciences section).