English version
УДК 577.2
К ВОПРОСУ О СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДАХ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИДОВ НЕМАТОД - ВИРУСОНОСИТЕЛЕЙ
Романенко Н.Д., Петруня И.В., Таболин С.Б.
Центр паразитологии ИПЭЭ РАН
Введение. Нематоды являются обитателями различных типов почв, растений и животных, включая человека, многочисленных сельскохозяйственных и диких видов животных, насекомых, грызунов, пресмыкающихся и других представителей животного мира [1,4]. К настоящему времени описано свыше 20 тысяч видов фитонематод, из которых примерно 4000 видов относятся к группе фитопаразитов. Среди корневых нематод наиболее многочисленны эктопаразитические корневые нематоды, из которых особо опасны и широко распространены в мире представители семейств Longidoridae и Trichodoridae, являющиеся переносчиками многочисленных непо- и тобра- групп вирусов [4, 5]. В России до настоящего времени идентификацию видов нематод проводили по морфологическим и морфометрическим признакам. Одним из первых основополагающих фундаментальных изданий в области молекулярной биотехнолоии, где описываются молекулярно-генетические методы идентификации живых организмов является книга канадских исследователей Глика Б., Пастернака Дж. [2]. В книге подробно изложены основы генной инженерии: механизмы репликации, транскрипции и трансляции; методы клонирования, амплификации и секвенирования ДНК; затронуты другие важные молекулярно-генетические проблемы. В РФ с 2012 года в ФГБУ ВНИИКР начаты исследования в области разработки молекулярно-генетических методов идентификации основных возбудителей фитофторозов малины и земляники подобраны универсальные праймеры для рода Phytophthora и меченные флуоресцентными красителями TAMBRA зонды, специфичные для Ph. cactorum, Ph. fragariae, Ph. nicotianae, Ph. citricola. Исследования в области секвенирования ДНК различных видов и популяций фитопаразитических нематод с последующим проведением кластер – анализа и отработки методологии для нематод - вирусоносителей в РФ до настоящего времени не проводилась.
Материалы, методы и результаты. В Центре паразитологии ИПЭЭ РАН в сотрудничестве с ГНУ МСХА и ряда другин научных организаций впервые в РФ начаты исследования в области идентификации видовой принадлежности нематод - вирусоносителей семейства Longidoridae методом сравнительного анализа нуклеотодных последовательностей ДНК, кодирующую малую субъединицу рибосомальной РНК (18SrDNA), в соответствии c имеющимися зарубежными литературными данными [6]. В процессе первого этапа работы была отработана методика секвенирования нематод. Из нематод - представителей семейства Longidoridae, предварительно идентифицированных с использованием политомического ключа [3, 4] как Longidorus elongatus, проводили выделение тотальной ДНК. Тотальную фракцию ДНК выделяли с помощью набора "К-сорб" компании "Синтол". Для оптимизации процесса лизирования пробы с особями нематод замораживали после чего проводили оттаивание образцов. В ходе работы были модифицированы pH лизирующего буфера на более щелочную реакцию, что способствовало полному растворению покровных хитинизированных тканей нематод. Дальнейшее выделение нуклеиновых кислот осуществляли на сорбирующих колонках с содержанием протеиназы-К. Чистота получаемой фракции тотальной ДНК составляла 1.8-1.9 по соотношению A269/A280. Следующим этапом работы была оптимизация праймеров, комплементарных последовательностям участка 18s, а также D2D3 сегмента 28s ДНК нематод. На основании информации о последовательности праймеров, опубликованной в статье Кумари с соавторами [7], были получены новые данные о необходимости оптимизации термальных циклов при постановке ПЦР- реакции. Было проведено уточнение температуры отжига праймеров. На этом этапе выполнения работы была оптимизирована методика выделения фракции тотальной ДНК из индивидуальных особей нематод и были синтезированы 6 пар праймеров, комплементарных 18s, а также D2D3 сегментов 28s ДНК нематод. В дальнейшем осуществляли работы по оптимизации условий ПЦР-реакции и последовательности праймеров. Проводилась отработка методики выделения ДНК из отдельных особей лонгидорид фиксированных 96% спиртом в 1,5 мл - пробирках по следующей методике: 1) производили декантацию (отбор) спирта с подсушиванием исследуемого объекта на воздухе; 2) далее к исследуемому объекту добавляли 25 мкл стерильной воды и гомогенизировали тефлоновым пестиком; 3) к полученному гомогенизату добавляли 25 мкл буфера (0.2 M NaСl), 0.2 M (Tris-HCl, pH 8.0), 1% меркаптоэтанола и 4 мкл протеиназы к 10 мг/мл; 4) на заключительном этапе осуществляли процесс лизирования при 56°С. Таким образом, был завершен первый этап работы - отработка методики секвенирования нематод – лонгидорид. Амплификацию проводили с праймерами 988F (ctcaaagattaagccatgc), 1912R (tttacggtcagaactaggg). Реакционая смесь с hot-start Taq-pol (Синтол), в объеме 25 мкл по программе (95°-3 мин, (95° -10 сек, 60°С - 20, 72° - 30сек), 30 циклов, 72°С - 5мин). Наличие и размер ампликона устанавливали элекрофорезом в 1% агарозном геле, размер продукта составляет около 995 н.п.
После ферментативной очистки смесью экзонуклеазы I (Thermo) и щелочной фосфатазы (СибЭнзим) определяли первичную последовательность нуклеотидов на генетическом анализаторе ABI 3130xl (Applied Biosystems). Видовую принадлежность образца определяли методом сравнения нуклеотидных последовательностей с имеющимися в GenBank в программе BLAST и с полученными нами контрольными последовательностями в программе ClustalW. Построив филогенетическое дерево в программе СlustalW, было установлено, что исследуемый объект относится к виду Longidorus elongatus, что подтверждает поставленный предварительный диагноз с использованием политомического ключа [3, 4]. Ниже приводиться выявленная последовательность нуклеотидов для исследованного образца нематод лонгидорид выделенных из очага вирозных растений спиреи и черной смородины (AMV, RRSV и др.):
CTCCTTATACGGTGAGCCGCGATAGCTCATTACAACAGCCATCGTTTACTAGAAAATATTTATCCTACTTGGATAACTGTGGCAATTCTAGAGCTAATACATGCAAAAAAGCTCAGACTGAAAGGAATGAGCGCATTATTAGAATAAAAACCAA TCGGGTCTAAAAGCCCGCTGTTTGGTGAATCTGAATAACTTTGCTGATCgcacGGTCTAGTACCGGCGACGTATCTTTCAAGTGTCTGCCTTATCAACTTTCGATGGTAGGTTATACGCCTACCATGGTAGTAACG GGTAACGGA GAATAAGGGTTCGACTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTAссACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAAtTACCCACTTCCAGAACGGAGAGGTAGTGACGAAAAATAACGAG ACAGTCCTCTcTGAGGTCTGTCATCGGAATGGGTACAATTTAAATCCTTTAACGAGGATCTATTGGAGGGCAAGTcTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCGGTTAAAACGCTCGTAGTTGAATCTGCGGCCTGGGAGAATGGACCCCCGAAAGGGTGGTAACTGTTACTCCTAGCCTAAATTTTTAGTCTACTCTATGGTGCCTTTAACCGGGTGCTTAGAGTGACTGGAACGTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGCTTAAAGC
AGGCGAATTTGCCTGAATAAGGTGCATGGAATAATGGAATAGGACCTCGGTTCTATTTTGTTGGTTTTCGGAGCCTAGGTAATGATTAAGAGGAACAGACGGGGGCATTCGTATTCCGG
CGCTAGAGGTGAAATTCTTGGACCGCCGGAAGACGGACGACTGCGAAAGCATTTGCCAAG AATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTtAGAGT
Выводы. 1) Впервые в РФ проведено определение видовой принадлежности нематод вирусоносителей лонгидорид методом сравнительного анализа нуклеотодных последовательностей ДНК, кодирующих малую субъединицу рибосомальной РНК (18SrDNA) c имеющимися последовательностями [6]. Отработана методика секвенирования нематод: оптимизирована методика выделения фракции тотальной ДНК из индивидуальных особей нематод; синтезированы 6 пар праймеров, комплементарных 18s, а также D2D3 сегментам 28s ДНК нематод.
2) Установлена последовательность нуклеотидов в образцах лонгидорид из лугового биоценоза из ризосферы вирозных растений спиреи и черной смородины, предварительно идентифицированных по комплексу морфометрических и морфологических признаков как L. elongatus, используя политомический ключ для определения видов рода Longidorus [4].
3) С помощью построения филогенетического дерева (древа) в программе СlustalW была подтверждена идентификация вида Longidorus elongatus, ранее установленная по морфологическим и морфометрическим признакам.
Литература: 1. Вайшер Б., Браун Д. Знакомство с нематодами. Учебник для студентов. Изд-во Пенсофт. 2001. 208 с. 2. Глик Б., Пастернак Дж. – Молекулярная биотехнология. Принципы и применение, перевод с английского. М. Изд. Мир. - 2002. 3. Романенко Н.Д. //Тр. ГЕЛАН СССР. -1978. -С. 111-114. 4.Романенко Н.Д. Фитогельминты-вирусоносители семейства Longidoridae. Монография.- М. Изд. Наука, 1993.- 284с. 5. Романенко Н.Д. //Сб. мат. научн. конф. "Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями".- М.- 2006.- Вып. 7.- С. 326-330. 6.Holterman M. et al., 2006. «Phylum-Wide Analysis of rDNA Reveals Deep Phyligenetic Relationships among Nematodes and Acceleration Evolution toward Crown Clades” Mol. Biol. Evol., 23(9), 1792-1800. 7.Kumari S. at all. //Agricultural Science Research Journal.-2012.- Vol. 20122(9). Р. 505 – 511.
© 2015 The Author(s). Published by All-Russian Scientific Research Institute of Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants named after K.I. Skryabin.
This is an open access article under the Agreement of 02.07.2014 (Russian Science Citation Index (RSCI) and the Agreement of 12.06.2014 (CABI.org / Human Sciences section).