ВЫЯВЛЕНИЕ КОПРОАНТИГЕНОВ ПРИ ТРИХИНЕЛЛЕЗЕ
РЕАКЦИЕЙ СЭНДВИЧ-ИФА

Написанова Л.А.
ФГБНУ «Всероссийский НИИ фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений им. К.И.Скрябина»

Введение. Трихинеллез, один из наиболее опасных гельминтозоонозов, имеет широкое распространение в различных природных зонах. Это инвазионное заболевание представляет собой серьезную медицинскую, ветеринарную и социально-экономическую проблему, поэтому во многих странах с неизменным постоянством проводятся комплексные ветеринарно-медико-биологические исследования по данной проблеме.

Прижизненная диагностика трихинеллеза с помощью иммунологической реакции имеет большое значение при разработке мероприятий по борьбе с этим социально опасным заболеванием. Совершенствование методов очистки антигенов, методик постановки реакций, приготовления реагентов способствует развитию иммунодиагностики, повышению эффективности реакций.

Среди множества тест-систем на основе иммуноферментного анализа (ИФА), которые достаточно часто используются в медицинской, а также и в ветеринарной практике, сэндвич-ИФА позволяет обнаруживать антигены паразита в различных биологических жидкостях зараженных животных и выявлять инвазию на самых ранних стадиях [2, 5, 3].

В связи с вышеизложенным, целью наших исследований была разработка тест-системы сэндвич-ИФА для выявления антигенов в экстракте фекалий (копроантигенов) при трихинеллезе. Это позволит обнаруживать антигены на кишечной стадии развития паразита, а также упростить и сделать более безопасным отбор проб для исследования у животных.

Материалы и методы. Для проведения работы белых беспородных крыс заражали личинками лабораторного штамма Trichinella spiralis разными дозами. Через 45-60 дней методом переваривания в искусственном желудочном соке (ИЖС) получали инвазионных личинок трихинелл. Жизнеспособность проверяли под микроскопом. Часть выделенных личинок использовали для заражения животных. Другую часть выделенных личинок накапливали до необходимого объема, замораживая и сохраняя при температуре минус 20С до использования. Личинок трихинелл измельчали вручную на холоде до получения гомогенной массы, применяя прием поочередного замораживания-оттаивания. Процесс измельчения контролировали с помощью бинокуляра при увеличении х32. Экстрагирование проводили в течение 20 часов в физиологическом растворе в соотношении 1:4 на магнитной мешалке при 4С. По окончании экстрагирования суспензию центрифугировали при 20000 об./мин в течение 30 минут при 4С, осадок удаляли, а супернатант использовали в качестве экстракта. Концентрацию белка здесь и в последующем определяли по калибровочной кривой (предварительно построенной) на спектрофотометре Ломо-26 при длине волны 280 нм [1].

Очищенный антиген трихинелл готовили из экстракта методом гель-хроматографии. Разделение на фракции проводили на колонке, заполненной сорбентом Superose 12 Prep Grade с учетом замечаний Mayer, 1987. У полученных в процессе разделения фракций измеряли содержание белка и проверяли на активность и специфичность в иммуноферментной реакции. Отобранные фракции сливали вместе, измеряли содержание белка и использовали в дальнейшем для получения антител к антигенам Т. spiralis.

Антитела (IgG) к Т. spiralis получали из гипериммунной кроличьей сыворотки, используя методы осаждения и аффинной хроматографии.

Конъюгат готовили из очищенных аффинной хроматографией кроличьих IgG к T.spiralis, применяя периодатный метод, в качестве ферментной метки использовали пероксидазу хрена.

Экстракты фекалий получали следующим образом: свежесобранные фекалии тщательно смешивали с физиологическим раствором в соотношении 1грамм фекалий и 2 мл физ. раствора, затем центрифугировали при 8 тыс. об./мин в течение 5-10 мин на холоде. Надосадочную жидкость использовали в качестве испытуемого образца. Образец сохраняли до использования при минус 20 °С.

С целью постановки сэндвич-ИФА провели отработку параметров и режимов постановки реакции – определили оптимальную концентрацию антител, режим их фиксации на полистироловых планшетах, буфер для разведения; определили минимальный диагностический титр сывороток, рабочее разведение конъюгата и режимы инкубации сывороток и конъюгата.

Результаты. Для выполнения работы заразили личинками лабораторного штамма T. spiralis 31 беспородную крысу массой 120 г разными дозами. Четырнадцать крыс с дозой заражения по 2,5 тыс. личинок использовали для получения гельминтного материала. Остальные, получившие дозу по 4 личинки/г массы, использовали для сбора фекалий в разные сроки (4,12,20 день п/з) и приготовления из них экстрактов (17 проб). Из выделенных инвазионных личинок трихинелл, приготовили экстракт в количестве 12 мл с содержанием белка 16 мг/мл. В процессе гель-хроматографии экстракта на суперозе 12 Prep Grade получили 71 фракцию. Содержание белка во фракциях колебалось в пределах от 32 до 9000 мкг/мл. Проверили антигенную активность и специфичность фракций в ИФА. Наиболее диагностически эффективные фракции (5 образцов) объединили в пул, объем которого составил 15 мл, а содержание белка 1,8 мг/мл. Этот препарат использовали в качестве соматического очищенного антигена.

Антитела (IgG) к Т. spiralis получали из гипериммунной кроличьей сыворотки выделением гамма-глобулиновой фракции с помощью метода осаждения. Затем из гамма-глобулиновой фракции методом аффинной хроматографии на сорбенте с белком А из S. aureus выделили IgG по методике производителя сорбента. Объем препарата антител составил 8 мл, содержание белка 0,5 мг/мл.

Постановку сэндвич-ИФА для выявления копроантигенов осуществляли на полистироловых планшетах отечественного производства.

Определение чувствительности тест-системы сэндвич-ИФА. При определении чувствительности использовали пул (смесь) экстрактов фекалий от незараженных трихинеллами лабораторных крыс. Пул разводили раствором для разведения образцов в диагностическом титре 1:2. В качестве положительного контроля использовали этот же пул, добавляя в него известную концентрацию – 800 нг/мл экскреторно-секреторного антигена трихинелл (ЭСАГ1) с последующим титрованием кратно 2 до концентрации 6.25 нг/мл. При автоматическом учете тест-система показала чувствительность 100 нг/мл (рис. 1). При визуальном учете различия между отрицательным и положительным образцом определялись только при концентрации антигенов 150-170 нг/мл. Фон присутствует, по-видимому, из-за использования конъюгата, приготовленного на основе менее очищенных антител к T. spiralis.

Далее провели предварительную проверку чувствительности на экстрактах фекалий от экспериментально зараженных T.spiralis крыс в дозе 4 лич/г массы животного и следующими сроками инвазии: 4, 12 и 20 дней (табл.).

Таблица. Выявление антигенов трихинелл в экстрактах фекалий экспериментально зараженных крыс при трихинеллезе

Как видно из таблицы, из 17 проб от инвазированных трихинеллами животных положительный результат дали 9 образцов, сомнительный – 5 и 3 – отрицательный результат. Отрицательные результаты регистрировали на сроках 4 и 20 дни после заражения. Причиной этого, на наш взгляд, является недостаточный уровень антигенов в образцах в данные сроки.

Таким образом, в опытах по постановке сэндвич-ИФА для выявления копроантигенов при трихинеллезе установили следующие оптимальные параметры и режимы реакции: концентрация очищенных антител для сенсибилизации полистиролового планшета 10 мкг/мл; титр испытуемых образцов (экстракт фекалий) – 1:2; режим сенсибилизации антител на полистироле – 18-20 часов при 4°С в 0.01М БКБ, рН 9.6; инкубация с образцами 40 минут и с конъюгатом 30 минут в термостате при 37°С. Раствор для разведения образцов состоит из 0.01М ФСБ, рН 7.2 с 0.9М NaCl, 0.05% БСА и 0.05% твина-20; конъюгат разводили 1:250 в таком же растворе с добавлением 0.5% БСА. Отмывку после каждого этапа реакции проводили 3 раза по 5 минут 0.01М ФСБ рН,7.2 с 0.9М NaCl и 0.05% твином-20. Субстратную смесь с ортофенилендиамином готовили на цитратном буфере стандартно. Реакцию останавливали стоп-реагентом, который состоял из дистиллированной воды и концентрированной серной кислоты в соотношении 1:1. Учет реакции проводили визуально и на автоматическом ридере при длине волны 492 нм. Чувствительность тест-системы сэндвич-ИФА в данном опыте при автоматическом учете составила 100 нг/мл антигенов по белку.

Заключение. Использование более очищенных антител для сенсибилизации полистироловых планшетов позволило несколько повысить чувствительность сэндвич-ИФА при выявлении копроантигенов трихинелл, однако, для дальнейшего увеличения чувствительности реакции необходимо использовать конъюгат, также приготовленный с использованием более очищенных специфических антител к Т.spiralis.

© 2015 The Author(s). Published by All-Russian Scientific Research Institute of Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants named after K.I. Skryabin.
This is an open access article under the Agreement of 02.07.2014 (Russian Science Citation Index (RSCI) and the Agreement of 12.06.2014 (CABI.org / Human Sciences section).